【產(chǎn)品名稱】NK細(xì)胞高效擴(kuò)增試劑盒

【產(chǎn)品組成】試劑盒套裝貨號(hào)：661070

套裝內(nèi)容	數(shù)量	單位	保存條件	產(chǎn)品性狀
NK Cell Culture Medium (661071)	2	瓶	2-8℃	液體
NK-A (661072)	1	支	-20℃	液體
NK-B (661073)	1	支	-20℃	液體
NK-C (661074)	1	支	-20℃	液體
NK-D (661075)	1	支	-20℃	液體
NK-E (661076)	1	支	-20℃	凍干粉
NK-F (661077)	1	支	-20℃	凍干粉

【1. 產(chǎn)品介紹】
??本產(chǎn)品是一款NK細(xì)胞高效擴(kuò)增的試劑盒。。外周血/臍帶血中的PBMC/CBMC細(xì)胞經(jīng)本試劑盒處理后，在14-16天時(shí)間內(nèi)，2L體系細(xì)胞總數(shù)可達(dá)到6×10⁹-8×10⁹，細(xì)胞存活率90%以上，NK細(xì)胞比例最高可達(dá)90%以上。
? 本試劑盒適用于人外周血/臍帶血和經(jīng)過血細(xì)胞單采儀處理獲得的白細(xì)胞等來源的樣品。
? 本試劑盒是在符合相關(guān)規(guī)范的無菌環(huán)境中生產(chǎn)，并已通過了嚴(yán)格的細(xì)菌、真菌、支原體、病毒（HIV、HAV、HBV、HCV）、內(nèi)毒素檢測(cè)。本試劑盒不含血漿、動(dòng)物源成分以及其他不明確成分。
【2. 用戶需要自行準(zhǔn)備的試劑耗材】
0.4%苔盼藍(lán)、生理鹽水、人淋巴細(xì)胞分離液、肝素鈉（鋰）采血管或100ml采血袋、PBS、75cm²懸浮培養(yǎng)瓶、175cm²培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)袋、15ml/50ml/250ml離心管、移液管、5ml和50ml無菌注射器等。

【3. 樣本采集及運(yùn)輸要求】

3.1、外周血樣本采集應(yīng)為肝素鈉采血管，臍帶血優(yōu)先選擇100ml采血袋，采集過程應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范無菌。實(shí)際采血總量應(yīng)大于50ml，采集后血液與抗凝劑應(yīng)及時(shí)混勻。
3.2、樣本運(yùn)輸條件為18-25℃，24小時(shí)處理樣本。

【4. T75培養(yǎng)瓶包被】
4.1、在75CM²懸浮培養(yǎng)瓶中加入8ml生理鹽水和1支NK-A，用電動(dòng)移液器吹打充分混勻；
4.2、讓混合液在培養(yǎng)瓶表面均勻分布；
4.3、在 37℃ 二氧化碳培養(yǎng)箱中水平放置120-150min；
4.4、小心取出混合液，包被后的培養(yǎng)瓶應(yīng)立即使用，不可劇烈晃動(dòng)。

【5. PBMC的分離和血漿制備（以50ml樣本THERMO ST16離心機(jī)為例）】
5.1 將 50ml 血液樣本均分至2個(gè)50ml離心管，3000rpm，10min，取上層血漿轉(zhuǎn)移至新的離心管，56℃，30min 滅活，4℃靜置10min，3000rpm，10min進(jìn)行離心，用吸管將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，-20℃分裝保存，使用前取出；
5.2 剩下細(xì)胞加入生理鹽水至原體積，充分混合均勻，轉(zhuǎn)移至2個(gè)裝有15ml淋巴細(xì)胞分離液的50ml離心管中，室溫下1800rpm，30min；
5.3 取出PBMC/CBMC至新的50ml離心管；加入生理鹽水至45ml，1600rpm，8min；
5.4 去上清，加入生理鹽水至45ml，充分混勻，取樣計(jì)數(shù)；
5.5 1400rpm，10min 收集PBMC/CBMC。

【6. 完全培養(yǎng)基使用說明】
6.1 第一瓶培養(yǎng)基｛NK Cell Culture Medium (661071)｝加入一支NK-E (661076)，充分混勻，配置成完全培養(yǎng)基，使用前恢復(fù)至室溫；
6.2 第二瓶培養(yǎng)基｛NK Cell Culture Medium (661071)｝加入一支NK-F (661077)，充分混勻，配置成完全培養(yǎng)基，使用前恢復(fù)至室溫；
6.3 按順序配置使用
【7. 細(xì)胞接種】
7.1 取包被瓶，去包被液待用；
7.2 取45ml完全培養(yǎng)基，加入一支NK-B和5ml自體血漿混勻；
7.3 用混勻后的完全培養(yǎng)基重懸已經(jīng)收集好的單個(gè)核細(xì)胞；調(diào)整細(xì)胞密度1.5-2.0×106cell/ml；（如初始細(xì)胞總數(shù)較少，按比例降低接種細(xì)胞體積,初始細(xì)胞總數(shù)不超過1×10⁸cell/ml）
7.4 D0（指接種當(dāng)天）轉(zhuǎn)移混勻后的細(xì)胞懸液至包被瓶，轉(zhuǎn)移過程中不可快速?zèng)_刷T-75培養(yǎng)瓶處理面，應(yīng)從側(cè)面緩慢加入后，再緩慢平放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
【8. 補(bǔ)液】
8.1 D3，鏡下觀察有較多克隆團(tuán)出現(xiàn)，即可補(bǔ)液，如有大量較大的克隆團(tuán)，可適當(dāng)打散（下同），??轉(zhuǎn)移細(xì)胞至T175培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加45ml完全培養(yǎng)基，一支NK-C和5ml自體血漿混勻；
8.2 D5，補(bǔ)加110ml完全培養(yǎng)基，加入一支NK-D和10ml自體血漿，混勻；
8.3 D7，補(bǔ)加200ml完全培養(yǎng)基和10ml自體血漿，混勻，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋；
8.4 D9，分袋，先將培養(yǎng)袋中細(xì)胞取一半均分到新的細(xì)胞培養(yǎng)袋中， 然后將400ml完全培養(yǎng)基和10ml自體血漿，混勻，均分到2個(gè)培養(yǎng)袋中；自體血漿如用完可不添加或用細(xì)胞營養(yǎng)添加物替代（下同）；
8.5 D11，往細(xì)胞培養(yǎng)袋中分別補(bǔ)加300ml完全培養(yǎng)基和5ml自體血漿，混勻；
8.6 D13，往細(xì)胞培養(yǎng)袋中分別補(bǔ)加300ml完全培養(yǎng)基5ml自體血漿，混勻；
8.7 如需擴(kuò)大培養(yǎng)體系（如3L、4L、6L、8L），使用 NK-F 因子配置的完全培養(yǎng)基繼續(xù)補(bǔ)液培養(yǎng)即可；
8.8 整體根據(jù)細(xì)胞密度適當(dāng)補(bǔ)液，補(bǔ)液后細(xì)胞密度不低于1.5×10⁶cell/ml。
【9. 收獲】
收獲NK細(xì)胞，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，適當(dāng)提前或延遲。

【注意事項(xiàng)】
1、 整個(gè)補(bǔ)液過程中，每次接種或補(bǔ)液體積因樣本、增值速度、初始細(xì)胞總數(shù)等會(huì)發(fā)生變化，應(yīng)維持補(bǔ)液后密度不低于1.5×106cell/ml；出現(xiàn)較多較大細(xì)胞團(tuán)可適當(dāng)打散，說明書7中的補(bǔ)液流程可根據(jù)實(shí)際細(xì)胞狀況做調(diào)整。
2、 分袋時(shí)間：根據(jù)試驗(yàn)的便利性，培養(yǎng)袋里面液體總體積達(dá)到1000-1500ml時(shí)分袋也可以，不局限于8.4中提到的D9天的分袋時(shí)間。
3、 細(xì)胞培養(yǎng)袋中總體積在1500-1600ml能最大發(fā)揮培養(yǎng)基效果，不宜過滿，當(dāng)總體積過大還需要繼續(xù)補(bǔ)液培養(yǎng)時(shí)應(yīng)及時(shí)分袋培養(yǎng)。