【產(chǎn)品名稱】NKT細胞高效擴增試劑盒

【產(chǎn)品組成】試劑盒套裝貨號：665070

【1. 產(chǎn)品介紹】
1.1本產(chǎn)品是一款 NKT 細胞高效擴增的試劑盒套裝。
1.2本產(chǎn)品適用于人外周血/臍帶血和經(jīng)過血細胞單采儀處理獲得的白細胞等來源的樣品。
1.3本產(chǎn)品是在符合相關(guān)規(guī)范的無菌環(huán)境中生產(chǎn)，并已通過了嚴格的細菌、真菌、支原體、病毒（HIV、HAV、HBV、HCV）、內(nèi)毒素檢測。

【2. 材料和設(shè)備】
用戶需要自行準(zhǔn)備的試劑耗材：
0.4%苔盼藍溶液、生理鹽水、人淋巴細胞分離液、肝素鈉（或鋰）采血管或 100ML 采血袋、PBS、T75cm² 懸浮培養(yǎng)瓶、T175cm² 培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)袋、15mL/50mL/250mL 離心管、移液管、5mL 和 50mL無菌注射器等。

【3. 樣本采集及運輸要求】
3.1 外周血樣本采集應(yīng)為肝素鈉采血管，臍帶血優(yōu)先選擇 100ml 采血袋，采集過程應(yīng)嚴格規(guī)范無菌。實際采血總量應(yīng)大于 50ml，采集后血液與抗凝劑應(yīng)及時混勻。
3.2 樣本運輸條件為 18-25℃，24 小時處理樣本。

【4. PBMC 的分離和血漿制備（以 50ml 樣本 THERMO ST16 離心機為例）】
4.1 將 50ml 血液樣本均分至 2 個 50ml 離心管，3000rpm，10min，取上層血漿轉(zhuǎn)移至新的離心管，56℃， 30min 滅活，4℃靜置 10min，3000rpm，10min進行離心，用吸管將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，-20℃分裝保存，使用前取出；
4.2 剩下細胞加入生理鹽水至原體積，充分混合均勻，轉(zhuǎn)移至 2 個裝有 15ml 淋巴細胞分離液的 50ml離心管中，室溫下 1800rpm，30min；
4.3 取出 PBMC/CBMC 至新的 50ml 離心管；加入生理鹽水至 45ml，1600rpm，8min；
4.4 去上清，加入生理鹽水至 45ml，充分混勻，取樣計數(shù)；
4.5?1400rpm，10min 收集 PBMC/CBMC。

【5. 完全培養(yǎng)基配置說明】
5.1 第一瓶培養(yǎng)基｛NKT Cell Culture Medium (665071)｝加入一支 NKT-E (665076)，充分混勻，配置成完全培養(yǎng)基，使用前恢復(fù)至室溫；
5.2 第二瓶培養(yǎng)基｛NKT Cell Culture Medium (665071)｝加入一支 NKT-F (665077)，充分混勻，配置成完全培養(yǎng)基，使用前恢復(fù)至室溫；
5.3 按順序配置使用。

【6. 細胞接種】
6.1 D0（指接種當(dāng)天），取 40ml 完全培養(yǎng)基加入 NKT-A(665072)和 NKT-B(665073)以及 5ml 自體血漿混勻待用；
6.2 用6.1配置的培養(yǎng)基重懸已經(jīng)收集好的單個核細胞；調(diào)整細胞密度?1.5-2.0×10⁶cell/ml；（如初始細胞總數(shù)較少，按比例降低接種總體積，初始接種細胞總數(shù)不超過1×10⁸cell/ml）
6.3 轉(zhuǎn)移混勻后的細胞懸液至T75cm² 懸浮培養(yǎng)瓶，混勻，再緩慢平放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

【7. 補液】
7.1 D3，鏡下觀察有較多克隆團出現(xiàn)，即可補液，如有大量較大的克隆團，可適當(dāng)打散（下同），轉(zhuǎn)移細胞至 T175 cm²培養(yǎng)瓶中，補加 40ml 完全培養(yǎng)基，一支 NKT-C 和 5ml 自體血漿混勻；
7.2?D5，補加 80ml 完全培養(yǎng)基，加入一支 NKT-D 和 5ml 自體血漿，混勻；
7.3?D7，補加 140ml?完全培養(yǎng)基和 5ml 自體血漿，混勻；
7.4?D9，補加 300ml 完全培養(yǎng)基和 5ml 自體血漿，混勻；轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋，自體血漿如用完可不添加或用細胞營養(yǎng)添加物替代（下同）；
7.5?D11，往細胞培養(yǎng)袋中補加600ml完全培養(yǎng)基和5ml自體血漿，混勻；
7.6?D13，分袋，每個細胞培養(yǎng)袋補加400ml 完全培養(yǎng)基和 5ml 自體血漿，混勻；
7.7 如需擴大培養(yǎng)體系（如3L、4L、6L、8L），使用 NKT-F 因子配置完全培養(yǎng)基繼續(xù)補液培養(yǎng)即可。
7.8 整體根據(jù)細胞密度適當(dāng)補液，補液后細胞密度不低于 1.5 x 10⁶ cell/ml；

【8. 收獲】
?收獲 NKT 細胞，可根據(jù)實驗情況，適當(dāng)提前或延遲。

注意事項
1、 整個補液過程中，每次接種或補液體積因樣本、增值速度、初始細胞總數(shù)等會發(fā)生變化，應(yīng)維持補液后密度不低于1.5×10⁶cell/ml；出現(xiàn)較多較大細胞團可適當(dāng)打散，說明書7中的補液流程可根據(jù)實際細胞狀況做調(diào)整。
2、 分袋時間：根據(jù)試驗的便利性，培養(yǎng)袋里面液體總體積達到1000-1500ml時分袋也可以，不局限于7.6中提到的D13天的分袋時間。
3、 細胞培養(yǎng)袋中總體積在1500-1600ml能最大發(fā)揮培養(yǎng)基效果，不宜過滿，當(dāng)總體積過大還需要繼續(xù)補液培養(yǎng)時應(yīng)及時分袋培養(yǎng)。?